Labor für Radioisotope

Untersuchungen zur DNA-Bindung des Transkriptionsfaktors STAT1



Projekt3






Abbildungslegende:



Oben: Nachweis der Hyperphosphorylierung einer Punktmutante des Transkriptionsfaktor STAT1 mittels Gelshiftanalyse.

Gezeigt ist das Ergebnis eines elektrophoretischen Mobilitätsshift-Assays von Extrakten transfizierter HeLa-Zellen, die Fusionsproteine von humanem Wildtyp-STAT1 (STAT1-WT, Bahnen 1-4) bzw. einer Punktmutante davon (STAT1-Mut, Bahnen 5-8) mit jeweils carboxyterminal gekoppeltem grünfluoreszierenden Protein (GFP) exprimieren.
Die Zellen wurden 45 min mit 5 ng/ml Interferon-γ (+IFNγ, Bahnen 2-4 und 6-8) stimuliert bzw. unbehandelt belassen (-IFNγ, Bahn 1 und 5) und nachfolgend für 0 min (Bahn 2 und 6), 30 min (Bahn 3 und 7) bzw. 60 min (Bahn 4 und 8) mit dem Tyrosinkinase-Inhibitor Staurosporin in einer Konzentration von 1 μM inkubiert.

Untersucht wurde die Bindung von Gesamtzellextrakten an eine einfache GAS-Bindestelle (M67), die zuvor mittels Klenow-Polymerase durch Einbau von [32P]-markierten Nukleotiden endterminal radioaktiv markiert wurde. Homodimere von nativem und rekombiniertem STAT1 wurden elektrophoretisch in einem nicht-denaturierenden Polyacrylamidgel aufgetrennt und das Ergebnis nach Trocknung des Gels im Phosphor-Imaginer dektiert.
Die Laufhöhe von GFP-gekoppeltem STAT1-Dimeren bzw. von endogenem STAT1 ist am rechten Gelrand angegeben. Die mit einem Stern gekennzeichnete Bande entspricht Heterodimeren von endogenen und GFP-konjugierten STAT1-Monomeren.

Beachte die gegenüber dem Wildtyp-Protein diskret verbesserte Tyrosin-Phosphorylierung und eingeschränkte Staurosporin-Sensitivität der eingesetzten STAT1-Punktmutante.




Unten: Demonstration der erhaltenen kooperativen DNA-Binding von Wildtyp-STAT1 und einer STAT1-Punktmutante der Coiled-Coil-Domäne.

Gesamtzellextrakte von Interferon-γ-stimulierten STAT1-negativen U3A-Zellen, die rekombinantes Wildtyp-STAT1 (Bahnen1-3) bzw. einer Punktmutante in der Coiled-Coil-Domäne von STAT1 (Bahnen 4 und 5) exprimieren, wurden zum Dimernachweis mit einer radioaktiv markierten Sonde bestehend aus einer singulären M67-Bindestelle (Bahn 1) und einer weiteren in Tandemanordnung befindlichen Sonde mit zwei STAT1-spezifischen Bindestellen (2xGAS) inkubiert (Bahnen 2-5).
Für Kompetitionsexperimente wurde in den Bahnen 3 und 5 ein 750-facher molarer Überschuss von unmarkierter Sonden-DNA für 30 min bei Raumtemperatur hinzugegeben.

Beachte, dass die Etramerbande als Folge von kooperativer DNA-Bindung durch die im Überschuss befindliche kalte Sonde einer Verdrängung widersteht, während die Dimerbande unter den gewählten Kompetitionsbedingungen bereits vollständig verschwunden ist.












LARI-Logo


Anschrift:
Labor für Radioisotope
Büsgenweg 2
37077 Göttingen
(Wegbeschreibung)

Leitung:
Prof. Dr. A. Polle


Ansprechpartner:
Bernd Kopka
Tel. +49 (0)551 / 39-8115 (Büro)
Tel. +49 (0)179 / 4515958 (Mobil)
Fax +49 (0)551 / 39-22705
bkopka@gwdg.de





Antragsformular-Icon-klein
Antragsformular
LARI-Nutzung