Masterarbeit

Co-IP von STRIPAK Komplex Proteinen in Sordaria macrospora und Identifikation neuer Interaktionspartner von SmPP2AA und PRO11


Zusammenfassung

Der “striatin interacting phosphatase and kinase“ (STRIPAK) Komplex ist ein Multiproteinkomplex, der in Eukaryoten wie den filamentösen Pilzen und dem Menschen zu finden ist, aber nicht in Prokaryoten oder Pflanzen vorkommt. Der STRIPAK Komplex steuert unterschiedliche Signalwege. Untersuchungen steriler Sordaria macrospora Mutanten haben gezeigt, dass die STRIPAK Proteine SmPP2AA, SmMOB3 und PRO11 essentiell für die Fusion vegetativer Hyphen und die Fruchtkörperentwicklung in S. macrospora sind. Die Interaktionen der STRIPAK Komplex Proteine sind jedoch weitgehend unverstanden. Aus diesem Grund wurden Co-IP Experimente durchgeführt, um Interaktionen zwischen den SmPP2AA, SmMOB3 und PRO11 Proteinen in vivo zu untersuchen.
Das zu Striatin homologe PRO11 kann Homodimere bilden und dient somit als Gerüst für die Assoziierung weiterer Proteine im STRIPAK Komplex. Die Calmodulin-Bindedomäne des PRO11 Proteins lässt auf die Beteiligung in Kalziumabhängigen Signaltransduktionswegen schließen. Für die Calmodulin und PRO11 Interaktionsstudien mittels Co-IP wurden Stämme generiert, die Calmodulin und PRO11 co-exprimieren. Die Co-IP Experimente konnten aufgrund der limitierten Zeit der Masterarbeit nicht durchgeführt werden und sind deshalb für die Zukunft geplant. Das SmMOB3 Protein ist ein putativer Kinase Aktivator der durch eine konservierte MOB Domäne charakterisiert ist und Ähnlichkeit zu der σ-Untereinheit des Clathrin-Adaptor Komplexes zeigt. In Hefe Two-Hybrid Experimenten konnte keine Homodimerisierung des SmMOB3 Proteins gezeigt werden, was durch Co-IP Experimente bestätigt werden konnte. Putative Interaktionspartner des SmMOB3 Proteins wurden durch GFP-Trap Analyse identifiziert und lassen auf eine Beteiligung des SmMOB3 Proteins in vesikulären Transport schließen. Bislang konnte keine Interaktion zwischen SmMOB3 und der Gerüsteinheit SmPP2AA gezeigt werden. Allerdings geben die Co-IP Experimente Hinweise auf eine Interaktion zwischen SmPP2AA und SmMOB3, die jedoch in zukünftigen Untersuchen überprüft werden sollte. Außerdem könnten GFP-Trap Analysen mit SmPP2AA als Köderprotein Aufschluss über eine mögliche SmPP2AA-SmMOB3 Interaktion geben. Diese konnten bislang nicht durchgeführt werden, weil die Generierung der benötigen Stämme für eine Masterarbeit zu zeitaufwendig war. Die Gerüstuntereinheit der Protein Phosphatase PP2A interagiert mit regulatorischen B Untereinheiten, die im STRIPAK Komplex assoziieren, um Substrate zu rekrutieren oder zur subzellularen Lokalisierung. In S. macrospora wurde die Interaktion der regulatorischen Untereinheit B’’’ PRO11 mit SmPP2AA untersucht. Es konnte keine direkte Interaktion zwischen PRO11 und SmPP2AA durch Co-IP gezeigt werden, diese wurde jedoch durch GFP-Trap Analyse bestätigt.