Protein-Mikroumgebungen in lebenden Hyphen

Viele Proteininteraktionen, die die Entwicklung steuern, sind schwach, transient oder dynamisch und gehen leicht verloren, wenn Zellen für eine klassische Affinitätsreinigung aufgeschlossen werden. Die proximitätsabhängige Biotin-Identifizierung (BioID) umgeht dieses Problem: Eine promiskuitive Biotin-Ligase wird an ein Köderprotein fusioniert und markiert benachbarte Proteine in der lebenden Zelle mit Biotin. Die biotinylierten Proteine werden anschließend aus denaturierten Zelllysaten angereichert und mittels Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie (LC-MS) identifiziert und quantifiziert.
Wir haben BioID für S. macrospora etabliert und dabei eine codonoptimierte TurboID-Biotin-Ligase eingesetzt. Als Machbarkeitsnachweis diente die STRIPAK-Komponente SCI1 als Köder; damit wurden die bekannten STRIPAK-Komponenten PRO11, SmMOB3, PRO22 und SmPP2Ac1 erfasst. Eine Methodenbeschreibung für das In-vivo-Proximity-Labeling mit miniTurboID wurde veröffentlicht. Angewandt auf den STRIPAK-Komplex führte das Proximity Labeling zur Identifizierung von DOC1 und DOC2 als Regulatoren der MAK2-Signalübertragung.