Forschungsprojekte


 

1.     Mechanismus des mRNA Scannens eukaryotischer Ribosomen

In eukaryotischen Organismen beginnt die Proteinsythese mit der Rekrutierung der kleinen ribosomalen Untereinheit zum 5‘ Ende der mRNA. Diese bewegt sich anschließend in Richtung des 3‘ Endes auf den kodierenden Bereich der mRNA zu. Diesen Vorgang bezeichnet man als mRNA Scannen. Die Erkennung des richtigen Startcodons löst die Bindung der großen ribosomalen Untereinheit aus, wodurch ein kompletter, translationsfähiger Ribosomenkomplex entsteht.

Die Vorgänge des mRNA Scannens und der Startcodonerkennung unterliegen besonderen Regulationsmechanismen. In diesen Schritten der Genexpression wird der Leserahmen eines jeden Proteins definiert, der die genaue Abfolge der Aminosäuren im Protein bestimmt. Weiterhin wird festgelegt, wie häufig eine mRNA vom Ribosom gelesen wird. So kann genau abgestimmt werden, wie viele Kopien eines Proteins in einer Zelle vorhanden sind.

Die molekularen Mechanismen des mRNA Scannens und der Regulation des mRNA Scannens sind weitestgehend unbekannt. Wir untersuchen diese Prozesse mit biophysikalischen Methoden auf Einzelmolekülniveau. Wir messen Änderungen in der Effizienz des Förster Resonanz Energietransfers (FRET) mittels Einzelmolekülfluoreszenzmikroskopie (Total Internal Reflection of Fluorescence (TIRF) Microscopy). Unser Hauptinteresse liegt darin, die basalen Prinzipien des Scannens zu verstehen, herauszufinden in welchem Zusammenhang sie zur ribosomeninternen Strukturdynamik stehen und zu erforschen, wie Regulationsfaktoren die Bewegung des scannenden Ribosoms beeinflussen.

 

2.     tRNA Translokation

tRNAs sind Adaptormoleküle, die bei der Proteinsynthese die richtige Aminosäure zum entsprechenden Codon auf der mRNA vermitteln. Wärend der Entstehung eines Proteins müssen sie die drei tRNA Bindestellen des Ribosoms (die sog. Akzeptor-, Peptidyl- und Exitstelle) passieren, auf denen jeweils die Auswahl der richtigen tRNA, die Ausbildung der Peptidbindung und die Dissoziation der leeren tRNA erfolgt. Den Vorgang der tRNA Bewegung durch das Ribosom nennt man Translokation. In vivo wird die Translokation durch einen ribosomalen Kofaktor, die GTPase Elongations Faktor G (EF-G) beschleunigt.

Mittels Einzelmolekül-FRET und TIRF Mikroskopie haben wir den Weg von tRNAs durch das Ribosom während der EF-G katalysierten Translokation dargestellt. Wir konnten zeigen, dass tRNAs dabei mehrere Zwischenzustände einnehmen, und wir konnten diese Zwischenzustände bereits veröffentlichten Kristallstrukturen zuordnen. Zusätzliche biochemische und kinetische Experimente ermöglichten die zeitliche Einordnung der Zwischenzustände auf der Translokationszeitachse.

In einem weiterführenden Projekt sind wir nun daran interessiert, ungewöhnliche Translokationsereignisse zu untersuchen. Insbesondere wollen wir herausfinden, welche Vorgänge während der Translokation zu Fehlern in der Proteinsequenz führen. Abweichungen von der richtigen Abfolge von Aminosäuren haben weitreichende Konsequenzen, wie z.B. die Ausbildung fehlgefalteter Proteine. Diese neigen zur Aggregation und verursachen Krankheiten, zu deren Aufklärung unsere Arbeit einen Beitrag leisten wird.

 

3.     Rotationsdynamik prokaryotischer Ribosomen

Effiziente Proteinsythese erfordert die genaueste Abstimmung interribosomaler Bewegungsabläufe. Wie bei einem Zahnrad greifen diese Abläufe ineinander. Die Wechselwirkung des Ribosoms mit seinen Liganden (Translationsfaktoren oder tRNAs) moduliert das Bewegungsmuster und optimiert es für seine jeweilige Aufgabe.

Mit Einzelmolekül FRET haben wir die Rotationsdynamik während der Translationstermination dargestellt. Dieser Vorgang wird durch Stopcodons in der mRNA eingeleitet, die das Ende der Proteinsythese signalisieren. Terminationsfaktoren binden dann ans Ribosom und lösen das fertiggestellt Protein ab, damit es seine Funktion in der Zelle aufnehmen kann. Verschiedene FRET Markierungen haben uns eine vielseitige Perspektive auf den Terminationsvorgang eröffnet, so dass wir ein umfassendes mechanistisches Modell, das die Bedeutung der Ribosomendynamik einschließt, erstellen konnten.

In folgenden Projekten interessieren uns Terminationsereignisse, die unabhängig von Stopcodons erfolgen. Unreife, fehlerhafte oder verkürzte mRNAs lösen die Rekrutierung einer besonderen Terminationsmaschinerie aus. Wir wollen mit Hilfe von Einzelmolekülfluoreszenz den Reaktionsmechanismus lösen.