Aktuelles (Stand: März 2020; in Zeiten von Corona)

März 2020. Neuigkeiten von NORFAB und von Abo-Vici (M. Höfer, W. Ecke) zum Vicin-Convicin-Gen. Bestätigung unserer Befunde, Fokussierung weiterer Analysen.  

Auf BioRxiv findet sich unter  https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2020.02.26.966523v1 
ein nicht begutachtetes Manuskript des NORFAB-Konsortiums. Das Kandidatengen RibA/Contig14304/RayContig4518  wird als Ursache der Vicin/Convicinarmut in Ackerbohne beschrieben. Die Autoren präsentieren einen funktionellen Assay mit einem aus V. faba  klonierten RibA-Protein, mit dem sie die biochemische Aktivität des Gens nachweisen. Die Ursache der Vicin/Convicin-Armut vermuten sie in einer Frame-Shift-Insertion in der GTP-Cyclohydrolase II-Domäne des bi-funktionellen Enzyms RIBA1, die exklusiv in der Genvariante des Niedrig-Vicin/Convicin Genotyps Mélodie nachgewiesen wird. Diese Daten werden durch Metabolitenstudien untermauert. Die Pyrimidin-Glucoside Vicin und Convicin werden über den Purinstoffwechsel mit GTP als Ausgangssubtrat synthetisiert. 

Der dort postulierte Biosyntheseweges benötigt noch vier weitere enzymatische Umwandlungen um zu Vicin und Convicin zu gelangen. Zu den korrespondierenden Genen (Desaminase, Hydrolase, Glycosyltransferase) werden in der Publikation keine experimentellen Daten präsentiert. Unsere Daten zeigen ebenfalls (siehe ältere Meldungen hier) die differentielle Expression von RibA/Contig14304/RayContig4518.

In unseren Datensätzen gibt es zwei weitere Contigs mit der Annotation „RibA“, die sich auf cDNA/mRNA-Sequenzebene von dem VC1/RibA-Gen unterscheiden aber zueinander sehr ähnlich sind. Beide RibA-Contigs kartieren gemeinsam in der gleichen Region auf Chromosom 4 von M. truncatula. Dieses möglicherweise „zweite“ Riba-Gen ist in unseren Daten nicht differentiell exprimiert. Das Schlüsselenzym der Riboflavin-Biosynthese ist RibA, und es muß auch in den Niedrig-Vicin/Convicin-Genotypen eine Versorgung mit Riboflavin (Vitamin B) sichergestellt sein. Ein dysfunktionales RibA/VC1 Gen kann diese Versorgung wohl nicht leisten. Wir vermuten daher, dass das putative zweite RibA-Gen für diese Versorgung der Pflanze mit zuständig ist. Unsere Transkriptomdaten zeigen niedrige aber Genotyp-unabhängige, konstante Expression für die zugehörigen Contigs. Dies könnte plausibel erklären, warum die vc1-Mutation zu keinem Null-Phänotyp sondern zu einem Niedrig Vicin/Convicin-Phänotyp führt. Die basale Enzymaktivität des zweiten RIBA-Proteins könnte neben der Synthese von Riboflavin im geringeren Umfang in Samenschalen auch weiterhin die Vorstufe für die Vicin/Convicin-Biosynthese liefern.  

Denkbar wäre auch, dieses zweite RibA-Gen zu nutzen, um den Vicin/Convicin-Gehalt in V. faba weiter zu verringern. Dies gilt analog auch für unsere weiteren Kandidatengene. Allerdings besteht auch die Möglichkeit, dass eine weitere Reduktion (z.B. über entsprechende genetische Varianten von einem zweiten RibA-Gen) pleiotrop zu phänotypischen Defekten führen könnte.

Unsere Daten weisen weitere, bisher nicht publizierte Kandidatengene aus (annotiert als Peroxidase, Glycosyltransferase oder Pectin-Lyase-Superfamilie, bzw. ohne Annotation), die über das gesamte sequenzierte Abo-Vici-Material differentiell exprimiert sind. Die bioinformatische und experimentelle (qPCR) Verifikation ist noch im Gange. Besonders interessant erscheint hier die Glycosyltransferase.



Neuigkeiten über die Vicin und Convicingehalte ausserhalb der Samen (Februar 2020)

Ausprägung des Vicin + Convicingehaltes (% in der TM) in Spross und Wurzel von Ackerbohnen-Genotypen, die sich stark im Samengehalt an V+C unterscheiden (Bachelor-Arbeit Reese 2020).

Genotyp

Samen-
VC-
Status

Wurzel

Stängel

Blatt & Blüte

Vor
Blüte

Blüte

Vor
Blüte

Blüte

Vor
Blüte

Blüte

Sommerackerbohnen

Linie VC-

848-3

VC-

0,046

0,036

0,024

0,023

0,000

0,000

LinieVC+

848-4

VC+

0,380

0,354

0,068

0,047

0,039

0,000

F1

-/+

0,128

0,129

0,035

0,029

0,000

0,000

+/-

0,418

0,238

0,053

0,039

0,051

0,018

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Linie VC-

201-3

VC-

0,057

0,040

0,021

0,015

0,000

0,000

Linie VC+

201-4

VC+

0,307

0,258

0,060

0,043

0,067

0,033

F1

-/+

0,147

0,090

0,039

0,030

0,000

0,000

+/-

0,413

0,185

0,064

0,038

0,079

0,021

Winterackerbohnen

WAB_98-98-3-

VC+

0,900

0,296

0,132

0,000

0,000

0,000

S_097-1-1-1-5

VC+

0,4583

0,015

0,075

0,005

0,000

0,000

Mittelwerte

 

VC-

0,095

0,073

0,0306

0,024

0,000

0,000

VC+

0,479

0,224

0,076

0,029

0,039

0,012







Drittes Jahrestreffen Abo-Vici in Hohenlieth.jpg
TO 2019.JPG
!!ICLGG 2019b Poster_wl1 für CiBreed  hall.jpg
TO zweites Treffen 2018
Gruppenfoto_Okt_2018_zweites_Abo-Vici_Treffen-KK.jpg


Dieses zweite Jahr (2018) brachte das Abo-Vici-Projekt weit voran! 


Die Herbstsaat der geplanten Feldversuche gelang zufriedenstellend, trotz extremer Trockenheit ("Jahrhundertsommer").

 

Am 9. Oktober fand das zweite Jahrestreffen statt, wieder in Göttingen (siehe Gruppenfoto oben). Als externer Gast wurde die dänische Züchterin W. Füchtbauer eingeladen, die das NORFAB-Projekt vorstellte. 


Folgende Kollegen und Kolleginnen nahmen am Treffen teil:


> Gabi Krczal, Michael Höfer; AlPlanta
> Knut Schmidtek, Werner Vogt-Kaute; HTW Dresden und Naturland
> Olaf Sass, Gregor Welna; NPZ Lembke
> Wolfgang Siegert; Universität Hohenheim
> Ingrid Halle, FLI Braunschweig
> Winnie Füchtbauer; Sejet und NORFAB, DK (externer Gast)
> Rebecca Tacke, Wolfgang link, Wolfgang Ecke, Regina Martsch; Univ. Göttingen
> Luiz Massucati, BLE / BMEL (Projektträger)

  

In Dresden wurden die geplanten Klimakammer- und Feldversuche durchgeführt (incl. Feldversuche in Wartmannsroth) und die Kooperation mit dem Deutschen Wetterdienst weit vorangetrieben. Die Resultate zum Leguminosen-Müdigkeitsversuche aus Göttingen müssen nun mit den Resultaten aus Dresden zusammengeführt werden. Die HPLC-Methodik zur Analyse von Vicin und Convicin wird zusätzlich in Dresden etabliert.

 

In Göttingen wurden alle geplanten Experimente durchgeführt, Saatgutproduktion, Futterproduktion, Feldversuche, molekulargenetische Analysen. Es liegen nun erste Feinkartierungen für die chromosomale Umgebung des V+C Major-Locus vor, die dazugehörenden phänotypischen Werte sind in Arbeit. In der laufenden Gewächshaussaison werden wiederum isogene unreife Samenschalen geerntet, um mit molekulargenetischen Methoden (genomweite Transkriptomanalysen) die Anzahl bisher identifizierten Kandidatengene einzuschränken. Diese Arbeiten laufen in Neustadt

 

Von Michael Höfer wurden Ergebnisse aus dem Vergleich von zwei Paaren nah-isogener Linien vorgetragen, an denen eine vergleichende Transkriptom-Analyse (mit RNA aus unreifen Samenschalen) durchgeführt wurde. Die beiden Linienpaare stammen aus zwei verschiedenen Kreuzungen. Ihre beiden Niedrig-Vicin/Convicin-Linien haben ein gemeinsames Segment auf Chromosom 1. Die molekulare Ursache der Vicin/Convicin-Armut ist derzeit noch unbekannt. Die bioinformatische Analyse der Hochdurchsatz-Sequenzierung und der Vergleich über beide F5-abgeleiteten Paare lieferte Daten für differentielle Genexpression sowie über strukturelle Veränderungen der mRNA-Sequenzen in Form von SNPs und Insertionen bzw. Deletionen. Darüber hinaus wurde aus den Daten ein Samenschalen-spezifisches Referenztranskriptom erstellt.

 

Anhand der Expressionsdaten konnten differentiell exprimierte  Kandidatengene identifiziert werden. Mehr als 300 sog. Contigs weisen eine mindestens um den Faktor 3 höhere Expression in den zwei Genotypen mit dem WT-Vicin-Gehalt auf, über 100 Contigs sind um mindestens den gleichen Faktor in den Genotypen mit Niedrig-Vicin höher exprimiert. Ausgewählte Kandidaten werden aktuell an weiteren Genotypen mit kontrastierenden Vicin/Convicin-Gehalten mithilfe der quantitativen PCR überprüft. Eine zweite Transkriptomanalyse an weiterem geeignetem Material soll helfen, die Anzahl der potentiellen Kandidantengene auf ein Minimum zu reduzieren. 


Alle Transkripte für die bekannten Enzyme der Pyrimidin de Novo-Synthese erwiesen sich in unseren Daten als unauffällig. Zwei Contigs fielen durch ihre Expressionsmuster sowie durch  homozygote InDel-Unterschiede zwischen den Hoch- und Niedrig-Genotypen auf (Contig10165_3 und Contig4180_2): eine 3- bzw. 4-Basen-Insertion in den niedrig-Genotypen liegt vor. Contig 4180_2 besitzt außerdem 19 SNPs über die gesamte Länge seiner cDNA-Sequenz. Physikalisch kartieren beide Contigs in die interessante Region des Mt-Chromosoms 2. Als Annotation erscheinen „Glycosyltransferase“ und „Allantoinase“. Die mögliche Bedeutung für den Vicin/Convicin-Stoffwechsel ist bislang unklar. Noch ausstehend sind tiefergehende Analysen zu Deletions- und Insertions-basierten Polymorphismen.


Wegen Kandidatengen Allantoinase etc-S.JPG

Ein Bezugspunkt für unsere Arbeiten ist die Publikation von Ray et al. (2015) in ‚The Plant Genome‘. Die kanadischen Autoren berichteten von 6 putativen Kandidaten,  deren mRNA-Expression sich zwischen Vicin/Convicin-kontrastierten Genotypen unterschieden (niedrig bei niedrig-Vicin/Convicin, hoch bei hoch-Vicin/Convicin). Bei Überprüfung dieser 6 Kandidaten daraufhin, ob deren mRNA-Spiegel sich auch in unseren beiden Linienpaaren signifikant unterschieden gab es einen Treffer, Contig 4518. Dessen Expression war in den Abo-Vici-Daten im Mittel etwa 5% der Expression des jeweiligen hoch-Vicin/Convicin Genotypes. Der 370 bp-lange Contig 4518 wird bei Ray et al. (2015) aufgrund der geringen Sequenzinformation fälschlicherweise als "reticuline oxidase like protein" annotiert. Contig 4518 aliniert komplett zu unserem 1827 pb langen Contig „14304“ mit einem offenen Leseraster von 502 Anomosäuren, dessen Annotation lautet: "Bifunctional riboflavin biosynthesis protein RIBA1" . Die mögliche Bedeutung für den Vicin/Convicin-Stoffwechsel ist bislang unklar.

Anhand der SNP-Daten konnten mehrere hundert Sequenzen identifiziert werden, die (per Syntänie mit Medicago truncatula) in dem chromosomalen Abschnitt liegen, der höchstwahrscheinlich für die Vicin/Convicin-Armut verantwortlich ist. Ein Auswahl dieser SNPs wird derzeit von der AG Link in sog. KASP-Assays auf ihre Nutzbarkeit für die verbesserte genetische Kartierung des Vicin/Concicin-Locus überprüft. Es bestehen gute Aussichten, dass darunter Marker sein werden, die enger mit der Vicin/Convicin-Armut gekoppelt sind und daher eine schnellere und genauere Selektion im Züchtungsprozess erlauben. 

 

In Wartmannsroth wurde wiederum zusätzlich ein Demonstrationsversuch zum praktisch-züchterischen Teil von Abo-Vici gesät: Dieser Demonstrationsversuch dient als Kommunikationshilfe zwischen Abo-Vici und dem BLE-geförderten Demonstrationsnetzwerk Erbse/Bohne. 

Die Futterproduktion (inzwischen sind die Fütterungsversuche mit Hühnern via FLI Braunschweig angelaufen) wurde planmäßig - mit großzügiger Hilfe der Fa. NPZ Lemkbe - in guter Qualität abliefert. Für das Futter der Aminosäure-Verdaulichkeitstests (Hohenheim) steht aktuell noch das Schälen einer Partie aus. 

 

Aktuell blühen die Bohnen im Gewächshaus in Göttingen. Das Abo-Vici-Projekt läuft weiter nach Plan und mit sehr guten Aussichten auf Erfolg.



PosterGPBC2018final.jpg
Feldvisite_Apr_2018S.jpg
Guido Lux aus Dresden (links), mit Rebecca Tacke und Wolfgang Link in Göttingen 

Zusammen mit Rebecca Tacke hat Guido Lux (Dresden) die hier angelegten Versuchsfelder zu den Versuchsteilen 2.3 (Leguminosenmüdigkeitsversuch; Teil der Aufgabe 2: „Effekt des Gehaltes von V+C auf Keimlingsresistenz und Bestandesetablierung“) sowie 3.1 (Teil der Aufgabe 3: „N2-Fixierleistung, N-Flächenbilanzsaldo von Winter- vs. Sommerackerbohne“) aufgesucht (diese Versuche werden von der Dresdener Gruppe geleitet). Es wurden der Feldaufgang bonitiert und die später durchzuführenden Messungen von N2-Fixierleistung und N-Flächenbilanzsaldo im Versuchsfeld 3.1 vorbereitet. Außerdem wurde "leguminosenmüder" Boden vom Versuchsfeld des Versuchsteils 2.3 entnommen, welcher dann in Dresden für Kühlkammerversuche im Versuchsteil 2.2 genutzt werden soll. Das Foto oben zeigt die beiden mit W. Link nach getaner Feldarbeit bei der Besprechung.


Das (erste) Abo-Vici-Jahr 2017 (Stand Dezember 2017).

Abo-Vici, sprich ‚Abo-minus-vici‘.
Planmäßig waren in dieser ersten Abo-Vici-Saison die Gruppe „Schmidtke“ in Dresden, die Gruppe „Link“ in Göttingen, die Gruppe „Sass“ in Hohenlieth und die Gruppe „Höfer“ in Neustadt die wichtigsten Akteure. In Dresden wurden die Versuche in Klimakammern gestartet, um zum Vicin-Convicin-Gehalt in Wurzeln, Spross etc. der Ackerbohne Informationen zu bekommen und um die sog. Leguminosenmüdigkeit unter kontrollierten Bedingungen zu studieren. Ebenso wurde zur Leguminosenmüdigkeit der drei-ortige Feldversuch durchgeführt, incl. des Standorts Wartmannsroth (W. Vogt-Kaute). Die Bonitur- und Ertragsergebnisse liegen vor, über die Göttinger Resultate liegt eine abgeschlossene Bachelorarbeit vor (Boldischar, 2017). Vicin und Convicin kann wohl einen agronomischen Effekt haben, aber aktuell sieht der Effekt nicht sehr markant aus. Die Pathogen-Untersuchungen an Stichproben der Wurzelstrünke sind noch nicht abgeschlossen.

Das Saatgut für die Herbstsaat der Saison 2017/18 und die Frühjahrssaat 2018 wurde in Göttingen erfolgreich produziert, die Herbstsaat in Dresden und Göttingen und Wartmannsroth ist erfolgreich durchgeführt. Entsprechend wird sowohl Göttingen als auch Dresden und Wartmannsroth der Versuch zur Leguminosenmüdigkeit in 2018 wiederholt, nun mit doppelter Anzahl Pflanzen pro Genotyp. Zudem wurden in Göttingen und Dresden planmäßig ein weiterer Versuch ausgesät: zur agronomischen Leistung, insbesondere zur symbiotischen N2-Fixierleistung von Sommer- und Winterackerbohnen. In Wartmannsroth wurde zusätzlich ein Demonstrationsversuch zum praktisch-züchterischen Teil von Abo-Vici gesät: Es wurden Kreuzungen und Rückkreuzungen der Vicin- und Convicin-armen Sommerbohnenlinie Mélodie/2 mit der Vicin- und Convicin-haltigen Winterbohnenlinie Hiverna/2 vorgenommen. Solches Material wurde in Wartmannsroth zusammen mit der in Wertprüfung befindlichen Augusta und mit der Sorte Hiverna (beide Vicin- und Convicin-haltig) als Vergleich ausgesät. Dieser Demonstrationsversuch dient als Kommunikationshilfe zwischen Abo-Vici und dem  BLE-geförderten Demonstrationsnetzwerk Erbse/Bohne.

Das Saatgut für die Futterproduktion (Fütterungsversuche mit Hühnern ab Herbst Saison 2018) wurde planmäßig in Göttingen und Hohenlieth produziert, die Ernte war erfolgreich.

Das Erntegut des Leguminosenmüdigkeits-Versuches wurde nach Hohenheim gegeben, wo es aktuell auf Qualitätsparameter analytisiert wird, die Vicin-Convicin-Analyse wird via Göttingen aktuell vorbereitet (in Kooperation mit der Gruppe „Sass“).

Während der Saison wurden planmäßig unreife Samenschalen in verschiedenen Stadien von Paaren von isogenen Linien (Vicin-Convicin-kontrastiert) in Göttingen geerntet; in Neustadt (Gruppe „Höfer“) wurde entsprechend daraus mRNA extrahiert und auf ihre Qualität hin untersucht. In Kürze wird die mRNA zum Servicedienstleister für die RNA-seq-Analyse gegeben. Die sonstige Analyse der in zugänglichen Datenbanken vorliegenden RNA-Sequenzen (https://www.coolseasonfoodlegume.org) läuft planmäßig. Aktuell überlegen wir in Göttingen, die Feinkartierung rascher und intensiver als geplant in Angriff zu nehmen, wofür wir vorhandene, publizierte und Abo-Vici spezifische, neue SNPs verwenden werden.

Im Juli 2017 (siehe Gruppenfoto weiter unten) fand das Projekt-Treffen in Göttingen statt, es wurden umfangreich und detailliert Verabredungen zum Fortgang getroffen. Im September wurden von der Göttinger Doktorandin erste Resultate und Strategien bei der ICLGG in Ungarn vorgestellt und erste Kontakte zum skandinavischen NORFAB geknüpft.

Im Oktober war der Koordinator Gast beim Jahrestreffen dieses NORFAB-Projektes, welches als einen von mehreren Punkten ebenfalls das Vicin-Convicin-Thema bearbeitet. Ein vielversprechender weiterer Austausch wurde verabredet.  Ebenso arbeitete der Koordinator im Oktober in Stuttgart-Hohenheim bei dem internationalen TRUE-Projekt-Meeting mit und wiederum wurde zu verschiedenen Aspekten ein Austausch verabredet (Saatgut, Information).

Aktuell blühen die Bohnen im Gewächshaus in Göttingen, wo Saatgut für F2 (Kreuzungen zwischen den isogenen Linien) und wo neue Kreuzungen hergestellt werden. Das Abo-Vici-Projekt läuft bislang nach Plan und mit sehr guten Aussichten auf Erfolg.


Gruppenfoto07_2017-Abo-Vici_Treffen.jpg
Poster2017-final.jpg